Jumat, 10 Oktober 2023

Pendahuluan

Perilaku oviposisi nyamuk dimediasi oleh kombinasi isyarat visual, penciuman, taktil, dan kemo-taktil yang terkait dengan habitatnya. Banyak isyarat kimia yang memediasi perilaku oviposisi berasal dari fermentasi mikroba dalam wadah air. Secara khusus, metabolit mikroba berperan sebagai atraktan dan/atau stimulan oviposisi berbagai spesies nyamuk. Hanya sedikit penelitian yang mengevaluasi respons nyamuk terhadap kultur bakteri murni. Dalam penelitian terbaru, penulis melaporkan bahwa campuran 14 spesies bakteri yang diisolasi dari infus eksperimental daun tua bambu canebrake (Arundinaria gigantea) sangat menarik bagi Ae. aegypti dan Ae. albopictus.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi masing-masing isolat bakteri dari infus daun bambu sebagai atraktan oviposisi nyamuk dan untuk menentukan konsentrasi sel optimal dari isolat yang menghasilkan daya tarik maksimal.

Metodologi

Pemeliharaan nyamuk

Koloni nyamuk dipelihara dalam insektarium pada suhu ~28 °C, ~75 % RH, dan fotoperiode 14 jam terang:10 jam gelap, termasuk dua periode senja (masing-masing 60 menit). Telur untuk pemeliharaan koloni nyamuk diperoleh dari betina yang diberi darah di lengan manusia.

Bioassay

Bioassay dilakukan dalam kandang Plexiglas® (30 x 30 x 30 cm) yang dilengkapi dengan lengan kain stockinette. Di setiap kandang, dua cup polipropilen 125 mL, diisi dengan 30 mL isolat bakteri uji atau media kontrol, ditempatkan secara acak di sudut diagonal kandang bioassay. Sebuah piringan layar galvanis berlapis lem digantung di bawah bibir setiap cup. Setelah penempatan cup, 10 nyamuk betina hamil dipindahkan ke dalam kandang. Setelah periode pengujian 24 jam, jumlah betina yang terjebak di setiap layar dihitung dan persentasenya (berdasarkan jumlah total yang merespons) dihitung untuk cup pengujian dan kontrol.

Sumber isolat bakteri dan kondisi pertumbuhan

Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini sebelumnya telah dikultur dari bioaktif infus daun bambu (Arundinaria gigantea) dengan menggunakan media R2A. Empat belas isolat yang tercantum pada tabel 1 telah dimurnikan. Selanjutnya dikembangkan media R2A yang dimodifikasi (MR2A) untuk mendapatkan pertumbuhan isolat bakteri yang optimal. Media cair MR2A mengandung 1000 mg/L susu skim (Difco), 500 mg/L dekstrosa (Sigma), 50 mg/L ekstrak ragi (Fisher), 50 mg/L pepton (Fisher), 500 mg/L larut pati (Fisher), 100 mg/L natrium piruvat (Fisher), 50 mg/L asam casamino (Difco), 50 mg/L natrium klorida (Sigma), 100 mg/L magnesium sulfat (Fisher), dan 300 mg/L dipotassium fosfat (Sigma) pada pH 7,2. Media MR2A yang dimodifikasi digunakan dalam bioassay isolat bakteri.

Bioassay dari campuran bakteri yang dikultur

Sel bakteri (10⁴ sel per mL) dari masing-masing 14 isolat dicampur, kemudian 100 μL suspensi ini diinokulasi ke dalam 100 mL media MR2A dan ditumbuhkan selama 24 jam. Hemositometer digunakan untuk memperkirakan kepadatan sel bakteri dalam kultur MR2A, yang diencerkan secara serial (10 kali lipat) dengan air steril untuk mencapai kepadatan sel akhir 10⁶ hingga 10⁹ sel/mL dalam volume 30 mL yang terkandung dalam cup. Media MR2A (tanpa bakteri) ditambahkan ke dalam cup kontrol setelah diencerkan dengan air steril.

Respon nyamuk terhadap isolat bakteri tunggal

Isolat bakteri ditumbuhkan secara terpisah dalam media MR2A pada suhu 28 °C pada orbital shaker (120 rpm) selama 24 jam. Sel bakteri diencerkan hingga konsentrasi akhir 10⁸, 10⁷, dan 10⁶ sel/mL, ditentukan dengan hemositometer. Setelah pengenceran dengan air steril, 30 mL isolat dengan kepadatan sel tertentu ditambahkan ke dalam cup uji. Demikian pula media MR2A diencerkan dan ditambahkan ke cup kontrol. Setelah periode pengujian 24 jam, setiap bioassay dihentikan dan jumlah betina yang merespons dicatat.

Setiap percobaan bioassay mencakup enam kandang per kepadatan sel bakteri dan ketiga kepadatan sel untuk suatu spesies bakteri diuji pada hari dan waktu yang sama. Tiga percobaan diselesaikan untuk setiap spesies bakteri sehingga menghasilkan total 18 bioassay yang diselesaikan per kepadatan sel setiap spesies bakteri.

Analisis data

Untuk menentukan apakah respon nyamuk terhadap suatu perlakuan berbeda dengan respon mereka terhadap kontrol, jumlah total nyamuk yang terperangkap pada layar uji dan kontrol di setiap kandang dianalisis menggunakan regresi multinomial (PROC GLIMMIX). Nilai batas yang digunakan adalah P = 0,05 untuk prosedur False Discovery Rate (PROC MULTTEST) untuk melindungi terhadap kesalahan Tipe I saat menguji beberapa hipotesis nol. Dengan kata lain, jumlah pengujian yang dilakukan tidak secara signifikan meningkatkan kemungkinan terjadinya kesalahan tipe I. Analisis statistik data respon dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SAS® (versi 9.4, SAS Institute; Cary, NC). Setelah analisis statistik selesai, data respons diubah menjadi persentase untuk penyajian hasil secara grafis.

Hasil dan Pembahasan

Pengamatan Temperatur dan Kelembaban

Ae. aegypti betina menunjukkan ketertarikan yang signifikan terhadap 10⁷ dan 10⁸ sel/mL (P <0,01), namun menunjukkan penolakan secara signifikan terhadap 10⁹ sel/mL (P = 0,0015). Demikian pula, Ae. albopictus tertarik pada cup bioassay yang mengandung 10⁷ dan 10⁸ sel/mL (P <0,01) dibandingkan pada cup yang berisi media kontrol, tetapi Ae. albopictus betina tidak tertarik atau menunjukkan penolakan terhadap kepadatan sebesar 10⁹ sel/mL (P = 0,2664). Di antara 4 kepadatan sel berbeda yang diuji, Ae. aegypti betina berkisar antara 20% hingga 35% dan 11% hingga 22% untuk Ae. albopictus betina tidak terjebak dan tetap bebas di arena bioassay.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat daya tarik gravid Ae. aegypti dan Ae. albopictus terhadap infus daun bambu canebrake berkorelasi dengan biomassa daun dan waktu fermentasi. Demikian pula dengan pengamatan lain dari penulis lain bahwa asam karboksilat dapat bertindak sebagai penarik atau penolak, tergantung pada konsentrasinya. Selain itu, hasil yang ada saat ini menunjukkan bahwa ketika campuran isolat yang mengandung bahan kimia atraktif dan repelan diuji, lebih banyak Ae. aegypti dan Ae. albopictus betina tetap tidak responsif. Khususnya, jumlah nyamuk yang tidak responsif lebih rendah ketika kami menguji satu isolat bakteri.

Jumlah Nyamuk Aedes aegypti yang Terperangkap pada Atraktan

Uji perilaku masing-masing isolat bakteri menunjukkan bahwa tujuh isolat (B1, B2, B3, B5, B12, B13 dan B14) menghasilkan daya tarik yang signifikan secara statistik pada dua kepadatan sel. Dengan isolat ini, nyamuk gravid tertarik pada bakteri pada 10⁷ dan 10⁶ sel/mL, namun respon terhadap kepadatan sel bakteri tertinggi yaitu 10⁸ sel/mL tidak berbeda secara signifikan dengan respon terhadap media MR2A saja (P > 0,05). Di antara semua isolat yang diuji pada tiga kepadatan sel yang berbeda, sekitar 10% - 21% dari Ae. aegypti betina tetap bebas di arena pengujian.

Analisis Rata-rata Perbedaan Jumlah Nyamuk Aedes aegypti tiap Konsentrasi Atraktan

Dalam uji perilaku dengan isolat tunggal, Ae. albopictus betina secara signifikan tertarik pada 6 dari 14 isolat bakteri, namun masing-masing isolat menarik hanya pada kepadatan sel tunggal yaitu 10⁷ sel/mL (B1, B5, B7, B10 dan B13) atau 10⁶ sel/mL (B14). Dari seluruh pengujian ini, 1% hingga 22% Ae. albopictus betina tidak memberikan respon terhadap kedua pengobatan tersebut dan tetap bebas di arena ujian.

Ae. aegypti betina cenderung merespons kepadatan sel bakteri yang lebih rendah dibandingkan Ae. albopictus betina. Selain itu, beberapa spesies bakteri menarik Ae. aegypti tetapi tidak pada Ae. albopictus betina (misalnya B2, B3, B4, B6 dan B12), namun hanya B10 yang menarik Ae. albopictus dan tidak pada Ae. aegypti betina. Yang terpenting, beberapa spesies bakteri, yaitu B1, B5, B13 dan B14, sangat menarik bagi kedua spesies Aedes tersebut. Spesies bakteri ini jelas merupakan kandidat penting untuk penyelidikan lebih lanjut dan ditempatkan dalam perangkap.

Hasil ini menunjukkan bahwa tidak semua spesies bakteri menghasilkan isyarat kimia yang sama (atraktan atau penolak) atau jumlah atraktan pada kepadatan sel yang sama. Kemungkinan besar komposisi kimia semiokimia oviposisi bervariasi antar spesies bakteri, yang kemungkinan besar menyebabkan perbedaan respons kedua spesies nyamuk. Selain itu, variasi waktu pembentukan bakteri juga mungkin mengakibatkan perbedaan isyarat kimia secara kuantitatif dan/atau kualitatif.

Kesimpulan

 Hasil ini menunjukkan bahwa pada kepadatan sel tertentu, beberapa bakteri berpengaruh signifikan terhadap daya tarik Ae. aegypti dan Ae. albopictus betina ke lokasi oviposisi potensial. Meskipun beberapa bakteri sangat menarik bagi nyamuk betina, spesies bakteri lain dalam infus yang sama mungkin sangat bersifat repelan. Temuan ini menunjukkan bahwa bakteri atraktif terpilih dapat digunakan untuk mengeksploitasi perilaku orientasi kemotaktik nyamuk untuk tujuan pengendalian populasi. Penelitian tambahan akan diperlukan untuk menemukan pembawa yang cocok untuk formulasi spesies bakteri dengan pelepasan berkelanjutan yang dapat mempertahankan kepadatan sel yang diinginkan.

 

REFERENSI

Ponnusamy, L., Schal, C., Dawn, M.W., Consuelo, A., & Charles, S.A. (2015). Oviposition Responses Of Aedes Mosquitoes To Bacterial Isolates From Attractive Bamboo Infusions. Parasites & Vectors, 8(486): 1-8. Doi: 10.1186/s13071-015-1068-y.