Jumat, 15 September 2023

Latar Belakang

Demam berdarah adalah sindrom sindrom virus akut yang ditularkan oleh nyamuk yang disebabkan oleh salah satu dari empat serotipe virus dengue (DENV). Pada tahun 2019, Organisasi Kesehatan Dunia menetapkan demam berdarah sebagai salah satu dari 10 ancaman kesehatan global teratas. Diperkirakan 50 juta hingga 100 juta kasus bergejala terjadi secara global setiap tahunnya. Epidemi demam berdarah terjadi setiap tahun atau dalam jangka waktu beberapa tahun, dan peningkatan jumlah kasus memberikan tekanan besar pada layanan kesehatan. Nyamuk Aedes aegypti merupakan vektor utama penyakit demam berdarah. Upaya pengendalian populasi A. aegypti dengan penggunaan insektisida atau metode pengelolaan lingkungan belum efektif dalam mengendalikan demam berdarah sebagai masalah kesehatan masyarakat di sebagian besar negara.

Hanya sedikit percobaan acak terhadap metode pengendalian A. aegypti yang telah dilakukan, dan tidak ada yang menggunakan titik akhir dari demam berdarah yang dikonfirmasi secara virologi (VCD). Uji coba mobilisasi komunitas untuk mengurangi populasi A. aegypti di Nikaragua dan Meksiko menunjukkan kemanjuran yang sederhana (29,5%) terhadap serokonversi demam berdarah pada air liur penduduk. Wolbachia pipientis – jenis bakteri intraseluler obligat yang umum, diturunkan dari ibu, dan bersifat obligat – menginfeksi banyak spesies serangga tetapi tidak muncul secara alami pada A. aegypti. Transinfeksi A. aegypti yang stabil dengan beberapa strain wolbachia memberikan resistensi terhadap infeksi yang disebarluaskan oleh DENV dan arbovirus lainnya. Oleh karena itu, introgresi strain wolbachia yang “memblokir virus” ke dalam populasi lapangan A. aegypti merupakan metode pengendalian demam berdarah yang sedang berkembang.

Pendekatan ini melibatkan pelepasan nyamuk yang terinfeksi wolbachia secara teratur ke dalam populasi nyamuk liar selama beberapa bulan. Wolbachia memfasilitasi introgresi populasinya dengan memanipulasi hasil reproduksi antara nyamuk tipe liar dan nyamuk yang terinfeksi wolbachia: satu-satunya hasil perkawinan yang dapat bertahan adalah keturunan yang terinfeksi Wolbachia. Di sini, kami melaporkan hasil uji coba cluster-randomized yang menilai kemanjuran penyebaran nyamuk A. aegypti yang terinfeksi wolbachia strain wMel dalam mengurangi kejadian VCD di Yogyakarta, Indonesia. Uji coba ini didasarkan pada studi percontohan entomologi dan epidemiologi sebelumnya dalam kondisi geografis ini.

Bahan dan metode

Desain dan Pengawasan Uji Coba

Uji coba Applying Wolbachia to Eliminate Dengue (AWED) didukung oleh Tahija Foundation dan diselenggarakan oleh Universitas Gadjah Mada, Indonesia. Protokol ini telah diterbitkan sebelumnya dan tersedia dengan teks lengkap artikel ini di NEJM.org. Persetujuan masyarakat terhadap rilis wMel diperoleh dari pimpinan 37 kelurahan setelah melakukan kampanye pelibatan masyarakat dan komunikasi massa. Persetujuan tertulis untuk berpartisipasi dalam komponen klinis uji coba diperoleh dari semua peserta atau dari wali jika peserta masih di bawah umur. Selain itu, peserta berusia 13 hingga 17 tahun memberikan persetujuan tertulis.

Uji coba ini dilakukan sesuai dengan pedoman Dewan Internasional untuk Harmonisasi Praktik Klinis yang Baik dan disetujui oleh komite etika penelitian manusia di Universitas Gadjah Mada dan Monash University. Data uji coba dianalisis oleh ahli statistik uji independen. Penyandang dana tidak mempunyai peran dalam analisis data, dalam persiapan atau persetujuan naskah, atau dalam keputusan untuk menyerahkan naskah untuk diterbitkan.

Pengacakan

Singkatnya, lokasi uji coba adalah kawasan perkotaan yang berdekatan seluas 26 km2 dengan jumlah penduduk sekitar 311.700 jiwa. Lokasi uji coba dibagi menjadi 24 cluster, masing-masing berukuran sekitar 1 km2, dan jika memungkinkan, memiliki batas geografis yang akan memperlambat penyebaran nyamuk antar cluster. Dari 24 cluster, 12 cluster secara acak ditugaskan untuk menerima penyebaran nyamuk berlabel terbuka yang terinfeksi wolbachia (cluster intervensi), dan 12 cluster ditugaskan untuk tidak menerima penyebaran (cluster kontrol, disebut “cluster yang tidak diobati” dalam protokol).

Dalam kelompok intervensi, sebagian besar anggota masyarakat tidak mengetahui penetapan kelompok karena wadah pelepasliaran ditempatkan secara diam-diam di sebagian kecil properti perumahan untuk waktu yang terbatas. Tidak ada plasebo yang digunakan pada kelompok kontrol. Pengacakan terbatas digunakan untuk mencegah kemungkinan ketidakseimbangan dalam karakteristik dasar atau dalam distribusi spasial kelompok intervensi dan kontrol (lihat Lampiran Tambahan).

Penyebaran Wolbachia dan Pemantauan Entomologi

aegypti yang terinfeksi dengan strain wMel dari wolbachia bersumber dari koloni yang disilangkan, seperti dijelaskan sebelumnya.14 Pada tahun 2013, kami menemukan bahwa garis keturunan nyamuk Indonesia yang terinfeksi wMel ini lebih kecil kemungkinannya untuk menularkan DENV dibandingkan tipe liar A. aegypti. Telur nyamuk ditempatkan pada kelompok intervensi dari bulan Maret hingga Desember 2017. Setiap cluster menerima antara 9 dan 14 putaran penerapan. Rincian mengenai pelepasan nyamuk dan pemantauan wMel pada populasi nyamuk disajikan dalam Lampiran Tambahan. Pemantauan dilakukan dengan menggunakan jaringan 348 perangkap nyamuk dewasa (BG-Sentinel, BioGents).

Pendaftaran Peserta

Peserta direkrut dari jaringan 18 klinik layanan primer yang dikelola pemerintah di Yogyakarta dan Kabupaten Bantul yang berdekatan. Peserta yang memenuhi syarat adalah berusia 3 hingga 45 tahun, mengalami demam (baik dilaporkan oleh peserta atau diukur di klinik dan didefinisikan sebagai suhu dahi atau ketiak >37,5°C) dengan gejala 1 hingga 4 hari sebelum datang ke rumah sakit, dan pernah tinggal di rumah sakit. area percobaan setiap malam selama 10 hari sebelum timbulnya penyakit. Peserta tidak memenuhi syarat jika mereka memiliki gejala lokal yang menunjukkan diagnosis spesifik selain infeksi arboviral (misalnya diare parah, otitis, dan pneumonia) atau terdaftar dalam uji coba dalam 4 minggu sebelumnya.

Prosedur

Peserta memberikan informasi demografis, alamat tempat tinggal geolokasi, dan riwayat perjalanan terperinci selama 3 hingga 10 hari sebelum timbulnya penyakit. Sampel darah vena 3 ml diperoleh untuk pengujian diagnostik arbovirus. Tidak ada investigasi diagnostik lain yang dilakukan. Peserta dihubungi 14 hingga 21 hari setelah pendaftaran untuk mendapatkan status vital dan untuk menentukan apakah mereka telah dirawat di rumah sakit sejak pendaftaran. Tidak ada informasi mengenai tingkat keparahan klinis kasus VCD yang dikumpulkan, dan tidak ada informasi mengenai diagnosis klinis atau tingkat keparahan kasus non-VCD yang diperoleh.

Investigasi dan Klasifikasi Diagnostik

Peserta uji coba diklasifikasikan memiliki VCD jika sampel plasma yang diperoleh saat pendaftaran positif untuk DENV dalam pengujian multipleks (DENV, virus chikungunya, dan virus Zika) reverse-transcriptase-polymerase-chain-reaction (RT-PCR) atau dalam enzim -linked immunosorbent assay (ELISA) untuk antigen protein nonstruktural 1 (NS1) DENV (Platelia dengue NS1 [Bio-Rad]). Peserta diklasifikasikan sebagai kontrol dengan tes negatif jika sampel plasma yang diperoleh saat pendaftaran negatif dengan RT-PCR untuk DENV, virus chikungunya, dan virus Zika dan juga negatif dengan uji penangkapan ELISA untuk antigen DENV NS1 serta IgM dan IgG demam berdarah. Serotipe DENV ditentukan dengan menggunakan uji RT-PCR terpisah (Simplexa) oleh laboratorium independen di Lembaga Eijkman, Jakarta. Rincian metode diagnostik disediakan dalam Lampiran Tambahan.

Titik Akhir Primer, Sekunder, dan Keselamatan

Titik akhir primernya adalah VCD bergejala dengan tingkat keparahan apa pun yang disebabkan oleh serotipe DENV apa pun. Titik akhir sekunder yang dilaporkan di sini adalah VCD bergejala yang disebabkan oleh keempat serotipe DENV (DENV-1, DENV-2, DENV-3, dan DENV-4) dan infeksi chikungunya dan virus Zika yang bergejala dan terkonfirmasi secara virologi. Titik akhir keselamatan termasuk rawat inap atau kematian dalam waktu 21 hari setelah pendaftaran.

Analisis statistik

Ukuran sampel yang diperlukan untuk menunjukkan kejadian demam berdarah 50% lebih rendah di kelompok intervensi dibandingkan kelompok kontrol, yang dianggap sebagai ukuran efek minimum untuk nilai kesehatan masyarakat, terus berkembang seiring berjalannya waktu. Penjelasan lengkap tentang perhitungan ukuran sampel disediakan dalam Lampiran Tambahan. Singkatnya, kami menentukan bahwa 400 kasus VCD dan 1.600 kontrol tes negatif akan diperlukan untuk memberikan uji coba kekuatan 80% untuk mendeteksi kejadian VCD 50% lebih rendah di antara peserta dalam kelompok intervensi dibandingkan mereka yang berada dalam kelompok kontrol. Munculnya sindrom pernapasan akut parah virus corona 2 di Yogyakarta pada bulan Maret 2020 menghalangi perekrutan peserta di klinik secara terus-menerus, dan pendaftaran berakhir pada tanggal 18 Maret 2020.

Pada tanggal 5 Mei 2020, panitia pengarah sidang menyetujui rekomendasi penyidik ??sidang untuk menghentikan sidang, yang mana saat itu telah terdaftar 385 peserta dengan VCD. Rencana analisis statistik telah diterbitkan sebelumnya22 dan tersedia bersama protokolnya. Populasi percobaan yang digunakan dalam analisis efikasi mencakup semua peserta yang terdaftar dengan VCD, semua kontrol yang hasil tesnya negatif, tidak termasuk peserta yang telah terdaftar sebelum pembentukan wolbachia di seluruh kelompok intervensi (yaitu, 1 bulan setelah pelepasan terakhir di kelompok terakhir) dan tidak termasuk kontrol yang hasil tesnya negatif yang telah terdaftar pada bulan kalender di mana tidak ada kasus demam berdarah yang diamati di antara peserta. Analisis niat untuk mengobati yang utama mempertimbangkan paparan wolbachia sebagai klasifikasi biner berdasarkan tempat tinggal di kelompok intervensi atau kelompok kontrol. Tempat tinggal didefinisikan sebagai tempat tinggal utama selama 10 hari sebelum timbulnya penyakit.

Efek intervensi diperkirakan dari rasio odds agregat yang membandingkan peluang paparan (tempat tinggal di cluster intervensi) antara peserta dengan VCD dengan di antara kontrol tes-negatif, dengan menggunakan distribusi permutasi terbatas sebagai landasan untuk inferensi. Hipotesis nolnya adalah kemungkinan tinggal di kelompok intervensi akan sama di antara peserta dengan VCD seperti di antara peserta kontrol yang hasil tesnya negatif. Kemanjuran intervensi dihitung sebagai 100×(1−rasio odds agregat). Analisis eksplorasi yang telah ditentukan sebelumnya mengevaluasi kemanjuran intervensi dalam mencegah rawat inap dengan VCD. Analisis tambahan niat untuk mengobati pada tingkat cluster yang telah ditentukan sebelumnya dilakukan dengan menghitung proporsi peserta dengan VCD di setiap cluster.

Perbedaan proporsi rata-rata peserta dengan VCD antara kelompok intervensi dan kelompok kontrol digunakan untuk menguji hipotesis nol tidak adanya efek intervensi (statistik uji-t) dan untuk memperoleh perkiraan risiko relatif spesifik kelompok, dengan inferensi berdasarkan distribusi permutasi terbatas. Metode yang sama yang digunakan dalam analisis niat untuk mengobati yang dijelaskan di atas juga digunakan dalam analisis untuk titik akhir sekunder dari kemanjuran spesifik serotipe. Analisis ini melibatkan peserta dengan VCD yang disebabkan oleh salah satu dari empat serotipe DENV dan menggunakan populasi kontrol yang sama seperti yang digunakan dalam analisis primer. Tidak ada rencana yang ditentukan sebelumnya untuk mengendalikan beberapa pengujian dalam analisis titik akhir sekunder.

Analisis per-protokol mempertimbangkan kontaminasi paparan dengan menetapkan indeks paparan wolbachia untuk setiap peserta berdasarkan prevalensi wMel di kelompok tempat tinggal mereka saja, atau dengan menggabungkan frekuensi ini dengan riwayat perjalanan terakhir peserta. Model linier umum dipasang, dengan pengambilan sampel bootstrap seimbang berdasarkan tempat tinggal cluster, untuk memperkirakan risiko relatif VCD dan interval kepercayaan terkait di setiap kuintil paparan wolbachia, relatif terhadap risiko VCD pada peserta di kuintil terbawah paparan wolbachia.Rinciannya disediakan dalam Lampiran Tambahan.

Analisis statistik

Pembentukan wMel pada Populasi A. aegypti

wMel bertahan lama pada populasi A. aegypti di masing-masing dari 12 kelompok intervensi. Prevalensi wMel tingkat cluster rata-rata bulanan adalah 95,8% (kisaran interkuartil, 91,5 hingga 97,8) selama 27 bulan pengawasan klinis.

Peserta Uji Coba

Sebanyak 53.924 pasien di 18 klinik layanan primer disaring untuk kelayakan uji coba mulai 8 Januari 2018 hingga 18 Maret 2020, dan 8.144 pasien terdaftar. Dari jumlah tersebut, 6306 peserta memenuhi persyaratan untuk dimasukkan dalam analisis: 2905 peserta yang tinggal di kelompok intervensi wMel dan 3401 yang tinggal di kelompok kontrol. Empat peserta yang positif chikungunya secara virologi (satu di kelompok intervensi dan tiga di kelompok kontrol) dikeluarkan dari analisis. Tidak ada kasus infeksi virus Zika yang terdeteksi. Usia rata-rata peserta adalah 11,6 tahun (kisaran interkuartil, 6,7 hingga 20,9), dan 48,8% peserta adalah perempuan.

Sebanyak 295 dari 6306 peserta (4,7%) yang dilibatkan dalam analisis dirawat di rumah sakit antara pendaftaran dan tindak lanjut (14 hingga 21 hari kemudian). Insiden rawat inap karena sebab apa pun lebih rendah di antara peserta yang tinggal di kelompok intervensi (81 dari 2905 [2,8%]) dibandingkan di antara mereka yang tinggal di kelompok kontrol (214 dari 3401 [6,3%]) (rasio odds, 0,43; 95% interval kepercayaan [CI], 0,32 hingga 0,58). Insiden yang lebih rendah ini terlihat jelas di semua klinik. Tidak ada peserta yang meninggal antara pendaftaran dan tindak lanjut. Dari 6306 peserta, 385 (6,1%) memiliki VCD, dan 5921 (93,9%) diklasifikasikan sebagai kontrol tes-negatif. Usia dan jenis kelamin sangat cocok pada kedua populasi ini.

Analisis Niat untuk Mengobati

Insiden VCD secara signifikan lebih rendah di antara peserta yang tinggal di kelompok intervensi (67 kasus di antara 2905 peserta [2,3%]) dibandingkan di antara peserta yang tinggal di kelompok kontrol (318 kasus di antara 3401 peserta [9,4%]) (rasio odds, 0,23; CI 95%, 0,15 hingga 0,35; P=0,004). Ini mewakili kemanjuran perlindungan sebesar 77,1% (95% CI, 65,3 hingga 84,9). Efek intervensi terlihat jelas 12 bulan setelah pendirian wMel. Kemanjuran perlindungan serupa terhadap semua serotipe tetapi tertinggi terhadap DENV-2 (83,8%; 95% CI, 72,1 hingga 90,6) dan terendah terhadap DENV-1 (71,0%; 95% CI, 18,2 hingga 89,7) . Batas bawah interval kepercayaan 95% untuk kemanjuran perlindungan terhadap keempat serotipe lebih besar dari 0. Ada 13 rawat inap karena VCD di antara 2905 peserta (0,4%) di kelompok intervensi dan 102 rawat inap di antara 3401 peserta (3,0%) di kelompok kontrol (kemanjuran perlindungan, 86,2%; 95% CI, 66,2 hingga 94,3). Analisis niat untuk mengobati tambahan yang telah ditentukan sebelumnya menilai jumlah peserta dengan VCD sebagai proporsi dari seluruh peserta di setiap cluster. Di semua kecuali satu kelompok intervensi, proporsi kasus VCD lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol, sehingga menghasilkan risiko relatif sebesar 0,23 (95% CI, 0,06 hingga 0,47). Ketika dikelompokkan berdasarkan serotipe, risiko relatif VCD yang disebabkan oleh dua serotipe paling umum (DENV-2 dan DENV-4) secara signifikan lebih rendah pada kelompok intervensi dibandingkan kelompok kontrol.

Analisis Per-Protokol

Dalam analisis per-protokol, indeks paparan wolbachia diberikan kepada masing-masing peserta berdasarkan frekuensi wMel di kelompok tempat tinggal mereka saja atau dengan memperhitungkan juga frekuensi wMel dan waktu yang dihabiskan di lokasi lain. Kemanjuran perlindungan terhadap VCD meningkat seiring dengan peningkatan bertahap dalam indeks paparan wolbachia partisipan ketika mempertimbangkan kelompok tempat tinggal dan riwayat perjalanan terkini. Ketika hanya frekuensi wMel di cluster tempat tinggal yang dipertimbangkan, efek ambang batas diamati di mana hanya frekuensi wMel tingkat cluster yang lebih tinggi dari 80% yang bersifat protektif.

Diskusi

Penetapan wMel pada nyamuk A. aegypti di Yogyakarta mengurangi kejadian kasus VCD bergejala sebesar 77% pada penduduk usia 3 hingga 45 tahun. Hal ini meyakinkan bahwa kemanjuran perlindungan diamati terhadap keempat serotipe DENV dan dengan keyakinan terbesar diamati terhadap DENV-2 dan DENV-4, karena ini adalah serotipe yang paling umum. Kemanjuran perlindungan dalam mencegah rawat inap dengan VCD, yang merupakan gambaran pragmatis dari tingkat keparahan klinis, adalah 86%. Di 11 dari 12 kelompok intervensi, proporsi peserta dengan VCD di setiap kelompok lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol, yang menunjukkan replikasi biologis yang konsisten dari efek intervensi. Dasar konseptual dari desain tes negatif yang digunakan dalam uji coba ini, dan kerangka statistik untuk inferensi populasi, telah dijelaskan sebelumnya.

Demam akut yang tidak dapat dibedakan selama 1 hingga 4 hari ditetapkan sebagai dasar klinis untuk kelayakan peserta guna menghindari bias seleksi pada saat perekrutan dan untuk memungkinkan deteksi virologi pada kasus demam berdarah. Prosedur percobaan, seperti penyembunyian status paparan wolbachia peserta dari staf peneliti, dirancang untuk mencegah bias dalam tindak lanjut, pengujian laboratorium, dan klasifikasi hasil. Pelepasan nyamuk pada cluster intervensi dilakukan secara terbuka (tidak dikontrol dengan plasebo) selama beberapa bulan di setiap cluster selama tahun 2017. Tidak ada bukti bahwa hal ini mengubah perilaku anggota masyarakat dalam mencari layanan kesehatan pada tahun-tahun berikutnya, karena jumlah peserta yang memenuhi kriteria kelayakan yang sama didaftarkan dari kelompok intervensi dan kelompok kontrol. Populasi nyamuk yang terinfeksi wMel tidak statis, dan kontaminasi wMel yang heterogen secara spasial diukur di tepi kelompok kontrol pada tahun ke-2 percobaan.

Meskipun demikian, perkiraan kemanjuran dari analisis per-protokol, yang memperhitungkan paparan wMel baru-baru ini pada masing-masing peserta melalui perubahan prevalensi wMel di tingkat cluster atau pergerakan manusia, tidak melebihi perkiraan dalam analisis niat untuk mengobati. Kami merencanakan analisis eksplorasi yang lebih bernuansa di luar lingkup protokol saat ini untuk mengeksplorasi hubungan spasial dan temporal yang baik antara prevalensi wMel dan risiko VCD. Hasil kemanjuran yang dilaporkan di sini konsisten dengan hasil observasi laboratorium dan lapangan. Prediksi dari serangkaian model matematika menunjukkan bahwa penurunan penularan yang diamati pada A. aegypti yang terinfeksi wMel cukup untuk menurunkan angka reproduksi dasar hingga di bawah 1 di banyak tempat di mana demam berdarah merupakan endemik, sehingga dapat menghilangkan penyakit secara lokal. .

Studi lapangan non-acak sebelumnya di Australia dan Indonesia memberikan bukti adanya efek epidemiologi yang besar setelah wMel diintrogresi. Studi kuasi eksperimental terhadap penyebaran wMel menunjukkan bahwa kejadian rawat inap akibat demam berdarah dengue 76% lebih rendah di tujuh kelurahan di perbatasan barat laut Yogyakarta dibandingkan di tiga desa kontrol di perbatasan tenggara kota selama 30 bulan setelah penyebaran nyamuk. Bersama dengan hasil uji coba yang dilaporkan di sini, data ini menunjukkan bahwa ketika wMel ditemukan pada prevalensi tinggi pada populasi A. aegypti lokal, maka akan terjadi penurunan kejadian demam berdarah. Strain wol bachia lainnya, wAlbB, juga memiliki sifat penghambat patogen dan dapat diintrogresi ke dalam populasi lapangan A. aegypti. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan portofolio strain wolbachia, masing-masing dengan kekuatan dan kelemahan yang berbeda, untuk diterapkan sebagai intervensi kesehatan masyarakat di daerah dimana demam berdarah endemik.

Transinfeksi wMel yang stabil memberikan keadaan resistensi virus pada nyamuk A. aegypti yang melemahkan superinfeksi oleh beberapa flavivirus dan alphavirus yang penting secara medis. Berbagai mekanisme telah diusulkan untuk menjelaskan fenotip ini, termasuk pemicu efektor imun bawaan yang diinduksi wolbachia dan perubahan transportasi kolesterol intraseluler. DENV mungkin dapat mengembangkan resistensi terhadap wMel; namun, keharusan untuk melakukan infeksi secara bergantian antara manusia dan nyamuk, serta tindakan yang tampaknya rumit, dapat menjadi kendala bagi munculnya populasi virus yang resisten secara adaptif. Penelitian di masa depan harus mensurvei populasi arbovirus untuk mencari sinyal tekanan selektif terkait wolbachia. Pendekatan introgresi wMel mewakili kelas produk baru untuk pengendalian demam berdarah. Aspek yang menarik dari strategi ini adalah bahwa strategi ini dapat bertahan dalam populasi nyamuk dan tidak perlu diterapkan kembali. Uji coba di masa depan harus mengeksplorasi multivalensi intervensi tersebut, karena penelitian laboratorium menunjukkan wMel juga dapat mengurangi penularan virus Zika, chikungunya, demam kuning, dan Mayaro oleh A. aegypti.

 

REFERENSI

Pinto SB, Riback TIS, Sylvestre G, Costa G, Peixoto J, Dias FBS, dkk. (2021). Efektivitas penyebaran nyamuk yang terinfeksi Wolbachia dalam mengurangi kejadian demam berdarah dan penyakit lain yang ditularkan melalui Aedes di Niterói, Brasil: Sebuah studi kuasi-eksperimental. PLoS Negl Trop Dis 15(7): 0009556.