Kamis, 16 November 2023

Pendahuluan

Perilaku tigmotaksis terjadi baik pada vertebrata maupun invertebrata, terutama ketika individu menghadapi lingkungan baru, dan diduga terkait dengan perilaku mencari perlindungan untuk menghindari bahaya dari predator. Pada kecoa dan serangga lainnya, perilaku tigmotaksis positif diketahui berhubungan dengan perilaku mencari makan dan bersembunyi untuk menghindari predator atau ancaman lainnya, dan derajat tigmotaksis juga mempengaruhi perilaku melarikan diri kecoa. Kecoak lebih suka bersembunyi di celah sempit yang dapat memberikan umpan balik thigmotaxic yang cukup, dan mereka mengumpulkan informasi lingkungan menggunakan berbagai modalitas sensorik, termasuk masukan penciuman, pengecapan, dan sentuhan, untuk memandu keputusan pergerakan mereka. Antena adalah organ reseptif utama yang digunakan serangga untuk menerima rangsangan kimia atau mekanik untuk komunikasi sosial dan rangsangan thigmotaxic dan lingkungan.

Pada kecoa, antena juga dapat digunakan untuk mengevaluasi bentuk/struktur tempat berlindung untuk memungkinkan penyesuaian posisi guna memastikan kesesuaian terbaik dalam ruang. Antena tunggal kecoa Amerika cukup untuk membedakan posisi relatif objek target pada sudut 0, 45, dan 90 terhadap bidang horizontal. Dengan mengidentifikasi struktur geometris yang berbeda, kecoak dapat mencari tempat berlindung yang tepat. Tempat perlindungan tidak hanya memberikan perlindungan tetapi juga berpotensi memenuhi persyaratan fisiologis spesifik untuk perkembangan kecoa. Kecoa yang berkembang di daerah yang memiliki tempat berlindung menunjukkan laju perkembangan yang lebih cepat, bobot badan dewasa yang lebih tinggi, dan ootheca yang lebih subur dibandingkan kecoa yang berkembang tanpa tempat berlindung. Dalam penelitian ini mereka menggunakan kecoa Jerman sebagai subjek percobaan.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh rangsangan yang mencerminkan ciri-ciri geometris lingkungan, khususnya sudut potensi tempat berlindung, terhadap perkembangan kecoa Jerman.

Metode

Untuk mengevaluasi efek sudut perlindungan dengan lebih tepat, kami membandingkan lebih lanjut profil ekspresi gen 30-90 dan 180.

RNA extraction and RNA-seq library preparation

Kecoak sampel ditumbuk halus dalam buffer RLT (ditambah dengan 1% 2-mercaptoetanol), divorteks selama 30 detik, dan kemudian didinginkan di atas es selama 10 menit. Solusinya kemudian diputar pada 14.000 rpm untuk membuat pelet jaringan. Supernatan dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru, dan RNA diekstraksi menggunakan Mini Kit RNA-easy (Qiagen). Kualitas RNA diperiksa pada gel elektroforesis dan kemudian diukur menggunakan Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Setidaknya 20 mg total RNA / sampel digunakan untuk menyiapkan perpustakaan RNA-seq spesifik untai. Perpustakaan RNA-seq khusus untai dibangun mengikuti Zhong et al. (2011). Secara singkat, RNA poliA diperkaya dua kali dengan Oligo d(T)25 Magnetic Beads (NEB) dan kemudian dipanaskan untuk secara bersamaan mengelusi dan memfragmentasi RNA poliA dalam Campuran Reaksi ProtoScript II (23) dengan adanya hexamer acak dan oligo dTVN (NEB) .

CDNA untai pertama disintesis menggunakan kit sintesis cDNA ProtoScript II First Strand (NEB) pada suhu 45C selama 45 menit. CDNA untai kedua dibuat menggunakan DNA polimerase I (NEB) dan RNase H (NEB) yang ditambah dengan campuran dUTP (2 mM dATP, 2 mM dCTP, campuran 2 mM dGTP, dan 4 mM dUTP, ThermoFisher). Setelah perbaikan akhir dan tailing dA, cDNA untai ganda diikat dengan adaptor Illumina bentuk Y. Produk diperlakukan dengan DNA glikosilase urasil dan kemudian diamplifikasi dengan set indeks primer (lihat Tabel S15 untuk urutan oligo PCR). Sekuensing dilakukan pada platform Illumina NovaSeq 6000.

Gene expression estimation and DEG (differentially expressed gene) analysis

Genom kecoa Jerman GCA_000762945.2 digunakan dalam penelitian ini. Setelah penghapusan CDS duplikat, tidak lengkap, dan non-ATG, total 25.732 CDS referensi digunakan untuk ekspresi gen. Dengan pengaturan default, pembacaan mentah dipetakan terhadap CDS menggunakan bowtie 2 (Langmead dan Salzberg, 2012). Tingkat ekspresi gen diperkirakan menggunakan eXpress (Roberts dan Pachter, 2013). Untuk mengevaluasi apakah sudut tempat berlindung yang berbeda mempengaruhi ekspresi gen, DEG diidentifikasi dengan membandingkan profil ekspresi gen kecoa yang berkembang di tempat penampungan dengan sudut 30, 90, dan 180 dengan yang ada di tempat penampungan kertas.

Untuk lebih spesifik, profil ekspresi gen 90 dan 180 juga dibandingkan dengan 30 untuk memastikan efek sudutnya. DEG diidentifikasi menggunakan Bioconductor DESeq2 (v.1.12.4; Bioconductor 3.7), diikuti dengan uji Wald untuk memperkirakan tingkat penemuan palsu (FDR) (Love et al., 2014). Gen dengan tingkat FDR <0,05 dan perubahan lipatan R 2 kali lipat (nilai perubahan lipatan log2 R 1 atau % 1) dianggap diekspresikan secara berbeda. Anotasi DEG kemudian dilakukan dengan BLASTing terhadap database landmark (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/smartblast/smartBlast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs). Analisis istilah Gene Ontology (GO) dilakukan dengan menggunakan situs analisis online Gene Ontology (//geneontology.org/) untuk klasifikasi.

Analisis Data

Analisis statistik pemilihan individu tempat penampungan kecoa diperiksa dengan koefisien korelasi peringkat Kendall. Untuk memastikan apakah preferensi shelter berbeda pada pagi dan sore hari, hasil seleksi shelter individu kecoa antara pagi dan sore juga dibandingkan dengan menggunakan uji Mann-Whitney U. Untuk pemilihan tempat penampungan kecoa secara berkelompok, durasi perkembangan dan tingkat kelangsungan hidup nimfa yang dikembangkan di tempat penampungan dengan 30, 90, 180, dilakukan uji t Student. Untuk semua hasil analisis, nilai p <0,05 dianggap signifikan.

Result

High numbers of differentially expressed genes (DE-Gs) , diidentifikasi pada 2 hari pasca molting pada nimfa instar kedua dan keenam

Mereka mengumpulkan sampel pada empat titik waktu, yaitu 12 jam pasca molting dan 2 hari pasca molting, pada nimfa instar kedua dan keenam untuk menentukan apakah sudut perlindungan mempengaruhi ekspresi gen. Tingkat jumlah baca per gen dan fragmen per kilobase per juta (FPKM) ditunjukkan pada Tabel S5B dan S6. DE-G diidentifikasi dengan membandingkan tingkat ekspresi gen kecoa yang berkembang di 30, 90, dan 180 shelter dengan kecoa yang berkembang di shelter kertas. Pada 12 jam pasca molting, sangat sedikit DE-G yang diidentifikasi pada nimfa instar kedua atau keenam untuk salah satu dari tiga sudut perlindungan. Namun, efek sudut perlindungan yang berbeda terhadap ekspresi gen diamati 2 hari pasca molting. Untuk kecoak yang berkembang di 30 shelter, total 346 (1,34%) dan 297 (1,15%) DE-G diidentifikasi masing-masing pada nimfa instar kedua dan keenam.

Jumlah DE-G yang tinggi teridentifikasi pada kecoa yang berkembang di shelter dengan sudut besar (90 dan 180), namun tidak ada korelasi linier antara jumlah DE-G dan ukuran sudut. Jumlah DE-G yang teridentifikasi pada kecoa dari 90 shelter adalah 1.277 (4,96%, instar kedua) dan 445 (1,73%, instar keenam), dan jumlah yang sama untuk 180 shelter adalah 989 (3,84%, instar kedua) dan 445 ( 1,73%, instar keenam). Fungsi dan ID gen DE-G ditunjukkan pada Tabel S7A-l. Untuk mengevaluasi efek sudut perlindungan dengan lebih tepat, kami membandingkan lebih lanjut profil ekspresi gen 30-90 dan 180. Untuk nimfa instar kedua, lebih banyak DE-G yang diidentifikasi dari nimfa 2 hari pasca molting (680 dan 490 DE-G untuk 90 dan 180) dibandingkan nimfa 12 jam pasca molting (7 dan 117 DE-G untuk 90 dan 180). Untuk nimfa instar keenam, jumlah DE-G yang diidentifikasi dari 12 jam pasca molting dan 2 hari pasca molting pada umur 90 dan 180 adalah 199 (12 jam, 90), 34 (12 jam, 180), 138 (2 hari , 90), dan 395 (2 hari, 180)

Gene ontology analysis of second-instar nymphs at 2 days post-molting

Analisis ontologi gen kemudian dilakukan untuk memahami fungsi DE-Gs. Hasil GO, termasuk komponen seluler dan fungsi molekuler. Untuk gen yang diregulasi, istilah GO proses metabolisme metabolit seluler (GO:0043603) dan proses metabolisme (GO:0008152) diidentifikasi pada kecoa yang berkembang di 30, 90, dan 180 tempat penampungan. Istilah GO untuk proses metabolisme ATP (GO:0046034), respirasi seluler (GO:0045333), proses biosintesis senyawa nitrogen seluler (GO:0044271), sintesis ATP mitokondria ditambah transpor elektron (GO:0042775), transpor elektron mitokondria, dan NADH menjadi ubiquinone (GO:0006120) ditemukan pada kecoa yang berkembang di 90 dan 180 shelter. Istilah rantai transpor elektron aerobik (GO:0019646), perakitan kompleks yang mengandung protein (GO:0065003), fosforilasi (GO:0016310), dan biogenesis subunit kecil ribosom (GO:0042274) hanya ditemukan pada kelompok yang berkembang pada tahun 90 tempat penampungan.

Sebagai perbandingan, istilah proses metabolisme heterosiklik (GO:0046483) dan organisasi subunit kompleks ribonukleoprotein (GO:0071826) hanya ditemukan pada kelompok yang berkembang di 180 shelter. Mengenai istilah GO dengan gen yang diturunkan regulasi, perkembangan kutikula berbasis kitin (GO:0040003) diidentifikasi untuk shelter 90 dan 180, sedangkan proses homeostatis (GO:0042592), perkembangan larva (GO:0002164), siklus molting, berbasis kitin kutikula (GO:0007591), pengaturan arsitektur tabung, sistem trakea terbuka (GO:0035152), dan pengembangan sistem pernapasan (GO:0060541) hanya ditemukan di 90 shelter.

Gene ontology analysis of sixth-instar nymphs at 2 days post-molting

Dibandingkan dengan nimfa instar kedua, istilah DE-G dan GO yang ditemukan pada nimfa instar keenam relatif sedikit. Untuk gen yang diregulasi, sangat sedikit istilah yang ditemukan untuk digunakan bersama di antara perlakuan yang berbeda. Istilah proses biosintetik tengah (GO:0043604), proses metabolisme tengah seluler (GO:0043603), translasi sitoplasma (GO:0002181), ekspresi gen (GO:0010467), proses biosintetik peptida (GO:0043043), dan translasi (GO :0006412) diidentifikasi pada kecoa dari 30 dan 90 shelter. Untuk kecoa yang berkembang di shelter dengan sudut 180, DE-Gs diperkaya dengan istilah proses metabolisme aminoglikan (GO:0006022), pengembangan kutikula berbasis kitin (GO:0040003), dan proses katabolik kitin (GO:0006032).

Sebagai perbandingan, istilah yang terkait dengan 30 shelter adalah proses metabolisme ATP (GO:0046034), proses metabolisme senyawa nitrogen seluler (GO:0034641), penurunan energi melalui oksidasi senyawa organik (GO:0015980), pembentukan metabolit prekursor dan energi. (GO:0006091), dan proses metabolisme zat organik (GO:0071704). Meskipun 83 dan 106 DE-G ditemukan masing-masing untuk 30 dan 90 shelter, istilah fungsionalnya tidak teridentifikasi. Untuk kecoa yang berkembang di shelter 180, DE-G diperkaya dengan istilah pengembangan kutikula berbasis kitin (GO:0040003), morfogenesis cakram imajinal (GO:0007560), morfogenesis larva atau pupa instar (GO:0048707), siklus molting , kutikula berbasis kitin (GO:0007591), perkembangan pasca-embrio (GO:0009791), dan regulasi arsitektur tabung, sistem trakea terbuka (GO:0035152).

Analisis GO shelter 90 dan 180 derajat  dibandingkan dengan shelter  30 derajat pada instar kedua dan keenam

Untuk 90 dan 180 shelter, lebih sedikit DE-G yang teridentifikasi dibandingkan 30 shelter, dan jumlah istilah fungsional yang dianotasi juga lebih rendah. Istilah GO dapat diidentifikasi hanya untuk gen yang mengalami penurunan regulasi yang terkait dengan 90 vs. 30 pada nimfa instar kedua 2 hari pasca molting, 180 vs. 30 pada nimfa instar kedua 2 hari pasca molting, dan 90 vs. 30 dalam 12 jam pasca molting nimfa instar keenam. Istilah GO pengembangan kutikula (GO:0042335), proses metabolisme kitin (GO:0006030), dan proses metabolisme karbohidrat (GO:0005975) diidentifikasi untuk DE-G nimfa instar kedua yang diturunkan regulasinya di tempat penampungan 90, sedangkan istilahnya proses metabolisme karbohidrat (GO:0005975), proses metabolisme cadangan energi (GO:0006112), dan proses metabolisme polisakarida (GO:0005976) diidentifikasi untuk DE-G yang diturunkan regulasinya pada nimfa instar kedua di 180 tempat penampungan. Lebih sedikit istilah yang diperkaya diidentifikasi pada nimfa instar keenam; istilah yang diperkaya adalah proses metabolisme aminoglikan (GO:0006022), proses metabolisme kitin (GO:0006030), dan proses metabolisme senyawa yang mengandung glukosamin (GO:1901071).

Discussion

Ada juga bukti molekuler mengenai keterlambatan perkembangan nimfa. Pada nimfa instar kedua 2 hari pasca ganti kulit di 90 tempat penampungan, istilah GO yang terkait dengan perkembangan larva, siklus ganti kulit, dan kutikula berbasis kitin diturunkan regulasinya. Sebaliknya, pada nimfa instar keenam 2 hari pasca molting di 180 tempat penampungan, morfogenesis cakram imajiner, morfogenesis larva instar atau kepompong, dan perkembangan pascaembrionik mengalami penurunan regulasi. Istilah GO DE-G juga mencerminkan fase perkembangan yang berbeda: istilah "morfogenesis cakram imajiner" berkaitan dengan perubahan dari bentuk larva ke bentuk dewasa (http://www.informatics.jax.org/vocab/gene_ontology/ GO:0007560) . Singkatnya, tempat berlindung yang memberikan rangsangan taktil yang tidak mencukupi tampaknya menyebabkan respons stres pada nimfa kecoa Jerman. Stimulus taktil yang tidak mencukupi dari lingkungan tempat berlindung juga mengubah kebutuhan energi kecoak. Hasil analisis transkriptome menunjukkan bahwa istilah-istilah yang berkaitan dengan proses metabolisme ATP, sintesis ATP mitokondria ditambah transpor elektron, dan transpor elektron mitokondria teridentifikasi pada nimfa instar kedua yang berkembang di 90 dan 180 shelter serta pada nimfa instar keenam yang berkembang di 30 shelter.

Dari perspektif molekuler, gen yang terkait dengan perkembangan kutikula berbasis kitin dan siklus molting dipengaruhi pada nimfa instar kedua dan keenam di tempat penampungan dengan sudut masing-masing 90 dan 180. Perubahan istilah terkait kitin tampaknya menjadi indikator paparan serangga terhadap pemicu stres. Penurunan regulasi proses metabolisme kitin dan perkembangan kutikula berbasis kitin mungkin menunjukkan bahwa struktur, integritas, dan bahkan ketebalan kutikula terpengaruh. Dibandingkan dengan tempat penampungan kertas, kami tidak melihat tingkat kegagalan ganti kulit yang lebih tinggi. Karena kecoak yang berkembang di tempat penampungan dengan sudut 30 menunjukkan status perkembangan yang serupa dengan kontrol kertas, kami selanjutnya menggunakan 30 sebagai dasar perbandingan untuk lebih menekankan efeknya secara lebih spesifik. Jumlah DE-G yang diidentifikasi dari setiap perbandingan lebih sedikit dibandingkan dengan kontrol kertas. Tidak jelas apakah perbedaan ini disebabkan oleh bahan atau bentuk shelter.

Tempat berlindung sebanyak 30 sudah cukup dan tampaknya sangat disukai oleh kecoak dalam percobaan pemilihan tempat berlindung. Lebih sedikit DE-G yang diamati pada perbandingan 90 dan 180-30, namun kami masih dapat mengamati istilah fungsional yang terkait dengan perkembangan kutikula, proses metabolisme karbohidrat, dan proses metabolisme cadangan energi. Istilah GO ini mewakili efek yang dihasilkan hanya dari sudut tempat berlindung, karena efek dari tekstur tempat berlindung atau rangsangan lingkungan lainnya dapat dihilangkan selama perbandingan. Dengan demikian, efek sudut dipastikan berkorelasi dengan perkembangan kutikula dan metabolisme. Tidak mungkin untuk mengamati atau mengevaluasi perubahan morfologi dalam penelitian ini, namun nimfa kecoa yang tumbuh di tempat penampungan dengan sudut besar mungkin memiliki struktur kutikula yang lebih lemah dan mungkin lebih rentan dibandingkan nimfa kecoa yang dibesarkan di tempat penampungan kertas, sehingga mengakibatkan tingkat kematian yang lebih tinggi. Studi lebih lanjut tentang potensi perubahan struktural kutikula diperlukan untuk mengeksplorasi hipotesis ini

Conclusion

Dari analisis GO hasil DEGs menunjukkan bahwa gen yang mengalami penurunan regulasi berkaitan dengan proses perkembangan, proses metabolisme kitin, dan gen terkait lainnya. Perubahan ini mungkin disebabkan oleh respons stres Blattella germanica di tempat penampungan yang tidak memadai. Selain itu, hal ini juga mengubah kebutuhan energi kecoak, yang menyebabkan peningkatan regulasi gen yang terkait dengan proses metabolisme ATP. Pengaruh sudut dipastikan berkorelasi dengan perkembangan kutikula dan metabolisme

 

REFERENSI

Yun-Ru Chen, De-Wei Li. 2022. The impact of thigmotaxis deprivation on the development of the German cockroach (Blattella germanica) (Part 2). Iscience. Hal 1-7